华人抗体协会独家推送：中国抗体药物产业化与国产化专题——转染篇之壹达生物

在当前国内和国际不确定的新形势下，国际人员和货物流动受到限制，国际货运和供应链的不可控因素增加，进口仪器设备和试剂存在货期延长或断货的风险。从长远来看，复杂的国际政治因素，也会使国际供应链的不确定性和风险增大。在这种新形势下，生物仪器国产厂家将成为生物医药企业的有力保障。

作为国产拥有自主知识产权的专业细胞电转染仪器供应商，苏州壹达生物在科研、蛋白快速表达、细胞免疫治疗等专业应用领域开发了多款仪器，并取得国内外客户的广泛认可。壹达作为一家负责任的国产厂家，不断精进技术，持续改进，提供更有性价比的电转染仪器和有效的重组蛋白瞬转表达解决方案，帮助国内生物医药企业应对新形势下的挑战。

对于科研和生物医药企业来说，把外源的DNA、RNA或蛋白质转染进入细胞内已是最常规的日常工作。生物大分子转染技术已成为促使分子生物学等前沿技术向应用转化的桥梁。对于生物医药企业的临床前研究项目来说，进行分子水平、细胞水平或动物水平的药效学、药动学、毒理学研究时，通常需要表达制备mg至g级别的蛋白；或者IVD企业需要大量生产抗原和抗体等试剂原料。这时候，蛋白的顺利和正确表达能够显著加速生物医药企业的项目研发进程。

重组蛋白或抗体表达通常有两种方式：目的基因瞬时转染哺乳动物细胞的瞬时表达和目的基因稳定整合到哺乳动物细胞基因组的稳定表达。实际应用中选择瞬时表达还是稳定表达，主要根据工作量、所需蛋白的质量和数量以及项目的研发进程确定。对于大量的蛋白表达生产，首选稳定表达，蛋白产量更高，质量更稳定。但是，稳定细胞系的筛选需要投入大量的时间和资源。在项目的早期阶段，通常只需要mg到g级别的蛋白，这时候首选瞬时表达，因为瞬时表达速度更快、成本更低。瞬时表达也让研究者有更多时间专注于蛋白工程实验、结构设计、条件优化、产品可行性评估等。瞬时表达可以满足项目的临床前评估，用于筛选多个候选分子，从而加速“Proof of Concept”阶段。

不管是瞬时表达还是稳定表达，主要关注目标蛋白的两个参数：表达量和生物学活性。相关的影响因素主要有下面几个：表达载体、细胞类型、转染效率、培养基、培养方法和条件等。

01 表达载体

表达载体对蛋白的表达非常关键，它们是携带目的基因进入细胞内的载体媒介。表达载体包含很多元件：启动子、多克隆位点MCS、含有polyA的3端非翻译区3UTR。其他元件包括增强子、内含子、病毒扩增序列、IRES元件、筛选标记、复制起点、染色质重构因子等。表达载体的设计通常使用模块化策略，根据载体的用途和目的蛋白的类型整合不同的载体元件，实现更高的蛋白表达水平和蛋白正确的折叠及翻译后修饰，确保高水平的生物学活性。载体的构建和选择是非常复杂的，没有一个载体适用于所有的项目，要根据具体的用途和目的蛋白类型进行优化。载体元件的排布、方向以及元件之间的间隔序列可以显著影响载体复制和基因表达。尤其是，DNA元件二级结构信息可能受到周围序列的强烈影响。

和表达载体相关的另一个因素是基因序列优化。对于目的蛋白的基因序列，不能仅仅停留在关注基因序列对应的氨基酸序列。基因序列本身也存在二级结构，转录的mRNA可能抑制核糖体的翻译步骤，mRNA的降解信号序列，表达宿主比较少用的稀有密码子等，这些因素也会影响目的基因在宿主细胞内的转录和翻译效率。

此外，也要考虑蛋白翻译后的分泌步骤，已有文献表明重组蛋白的表达并不总是和它的mRNA水平相关，一个限速步骤可能是蛋白的分泌过程。不同的信号序列可以对蛋白质产量产生显著影响。

02 细胞类型

对于一个研发项目来说，很难选择一个工艺开发的起点。一个常规的起点是选择表达宿主，它和培养基、转染方法、表达载体具有直接的关联。对于科研和工业领域，蛋白表达最常用的细胞系是CHO和HEK293。HEK293通常用来瞬时表达，因为转染相对容易以及具有相对更高的表达量。但是，HEK293表达系统的糖基化和生物制品的最终宿主CHO细胞系存在差异。CHO细胞更多用于稳定表达，大约70%生物药物都使用CHO细胞系表达生产。虽然有一些生物药物的开发过程选择从HEK-293细胞系开始，完成筛选后再转到CHO系统。这种转变需要进一步优化培养基、表达载体、转染和筛选方法等。所以，更多的生物公司选择使用CHO细胞系作为生物药物项目的开发起点，和后期的稳定表达生产阶段细胞系保持一致，这样可以减少二次工艺开发步骤，保持重组蛋白的糖基化结果以及生物学活性的一致性。

03 转染效率

一旦选择了细胞系后，提高转染效率就成为一个最有效的提高产量的方法。目前常用的哺乳动物细胞转染方法主要有化学法、物理法和病毒法。化学法最早在1970年前后已开始使用，主要有阳离子聚合物如PEI、脂质体转染等。物理法主要是电转染，电转染已成为使用最广的蛋白表达转染方法。电转染可以用于瞬时和稳定转染，一旦确定最优的电转条件，可以在短时间内转染大量的细胞。随着电转技术的进步，市面上已有设备可以实现在保持高转染效率和高细胞活率的同时，一次性实现高达10¹⁰个细胞的转染，并且参数优化更加方便，工艺放大更稳定。病毒法主要是慢病毒、逆转录病毒等。病毒法的转染效率较高，但是，实际使用中具有一些明显缺点，比如开发难度大、时间长、成本高，需要额外的病毒扩增步骤、病毒存储，尤其生物安全性问题。所有病毒法都有一个共性，病毒需要被改造，避免病毒不可控的复制引起意外泄露。因此，不适用于临床使用重组蛋白的开发。此外，一个显著缺点是只能包装大约10kb，限制了可以表达的蛋白大小。

最优的转染方法需要具有高转染效率、低细胞毒性、高可重复性。选择转染方法依赖于细胞类型、所需要蛋白的数量以及成本。此外，也必须考虑下游的应用：比如脂质体转染在小规模时可以成功使用，而在大规模时并不具有成本效益。每种方法各有优缺点，在开发过程的每一阶段，都需要优化相应的关键参数。

04 培养基

对于生物医药企业来说，市面上已有很多种类的进口和国产的细胞培养基可以选择。目前通常使用无血清、无动物源成分、化学成分确定的培养基。培养基的选择除了要考虑本身的细胞培养、蛋白表达性能、成本等因素之外，也要考虑其他的一些因素。其中一个最关键的因素是细胞转染方法，要注意培养基中的一些成分可能会抑制特定转染方法的效率。比如枸橼酸铁和硫酸葡聚糖都能抑制PEI转染，虽然对增加蛋白的产量有益；此外，有文献指出一些市售培养基可能含有抑制PEI转染的成分，例如蛋白胨、磷酸盐、右旋糖酐硫酸盐、硫酸肝素、柠檬酸铁铵和某些水解物或其他未知成分。因此，选择支持PEI转染的培养基至关重要。

另一个需要考虑的因素是培养基成分也会影响蛋白的翻译后修饰，尤其是蛋白的糖基化，从而直接影响目的蛋白的生物学活性。多种营养成分、糖前体、氨基酸、微量金属、激素、培养基渗透压等都可以影响糖基化的类型和分布。

此外，细胞培养基不单单影响细胞生长和蛋白表达量，也会影响蛋白的质量。提高蛋白表达量不能以降低蛋白的质量为代价，比如糖基化改变、蛋白水解、蛋白聚团等。

05 培养方法与条件

细胞培养方法和细胞类型、培养基种类、转染方法等因素密切相关，不单单影响蛋白表达量，也会影响培养工艺的放大规模和放大难度。常用的细胞培养方法主要有贴壁培养和悬浮培养，其中悬浮培养是主流的细胞培养方法。和细胞悬浮培养相关的很多参数都会影响目的蛋白的表达量和生物学活性，比如培养容器体积、装量、转速、振幅、培养温度、补料工艺等。已有文献表明，细胞转染后适当降低培养温度，可以提高表达量。但是，要注意，不是所有的细胞和蛋白都对温度敏感，有些情况下，37℃的表达量反而更好。也有文献表明，细胞培养时通过补加一定浓度的小分子物质，也可以提高表达量，比如DMSO、硫酸铜、DMA、乙酸锂、丁酸钠和丙戊酸等。但是，这些小分子物质对细胞都会有一定的毒性，补加的浓度、时间点、处理细胞的持续时间等参数都需要测试优化。

影响蛋白表达量以及蛋白正确折叠和翻译后修饰的因素有很多，这些因素之间相互依赖相互影响，改变一个因素可能产生意想不到的下游影响。所以，一个表达系统的优化，不能只单独孤立地考虑一个因素，也应该考虑这些因素之间的相互关系和影响。通过基于系统的DOE策略，在优化单个因素的基础上，对整个表达系统进行进一步优化。基于此，苏州壹达生物对影响蛋白表达的几个关键因素，如细胞类型、转染效率、培养基、补料工艺等进行了优化，形成一套有效的整体电转解决方案。

在对转染的细胞量需求不高的时候，比如构建稳定细胞系、构建细胞模型、干细胞研究、细胞治疗、基因编辑、工艺参数优化等，壹达X-Porator H1型号电转染仪是高性价比的选择。

当需要制备大量目的蛋白用于临床前研究时，大量瞬时表达就成为必需的快速、高性价比的选择。壹达自主专利X-Porator F1型号流式电转仪可以轻松实现3-100ml规模的大体积电转，实现高达1.5L的细胞培养；除具备优化的电转参数外，壹达还提供从瞬转细胞系到国产替代培养基和补料以及培养条件等完整解决方案，实现最终表达量相比化转提高约2-5倍甚至数十倍。从而，显著缩短项目的研发时间，提高项目研发的成功率，同时节省成本。

推荐合适的瞬转表达细胞系

壹达生物针对常用的四种瞬转细胞系293F、Expi293F、CHO-S和ExpiCHO-S，分别测试了抗原、抗体（单抗、双抗）、融合蛋白等分子的电转瞬时表达，发现ExpiCHO-S细胞在表达量上明显优于其他3种细胞系；壹达电转系统也适用于其它不同细胞的转染，但是在蛋白表达量方面，首先推荐ExpiCHO-S细胞系。

筛选国产细胞培养基和补料

壹达生物在优化电转参数的基础上，也对市场上常见的国产瞬转培养体系进行了测试，从中筛选出适合电转仪器的细胞培养基、培养条件以及补料，进一步显著提高蛋白表达量；同时优化了补料方案，整个培养期间只需开盖补料2次，大大减少工作量和污染风险。